杜仲黄酮类3种药物成分治疗大鼠骨质疏松的 [复制链接]

杜仲黄酮类3种药物成分

治疗大鼠骨质疏松的比较研究

袁真1闵珺2王恺1龙菲1王永静1罗军1通讯作者

(1.医院,江西南昌;2.医院,江西南昌)

近年来,骨质疏松症的发病率逐年增多,疼痛本身可降低患者的生活质量,脊柱变形?骨折可致残,不仅患者生命质量受到严重影响,也给个人?家庭和社会带来沉重的经济负担?因此,治疗骨质疏松成为当前迫切需解决的问题?杜仲叶具有抗骨质疏松的疗效,本课题组前期开展对杜仲叶提取物化学成分的系统研究发现,杜仲黄酮类抗绝经后骨质疏松能力最强?已有研究证实槲皮素?山奈酚?芦丁这3种杜仲黄酮类药效成分均有抗骨质疏松的作用?本研究拟通过对比分析槲皮素?山奈酚?芦丁3种主要黄酮类药物成分相同浓度下抗骨质疏松的效果,为今后发展中药治疗绝经后骨质疏松症提供有效的临床依据?

1.1材料

1.1.1动物:10~11周龄健康雌性SD大鼠,体重~g,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号:SCXK(京)-?整个实验期间,动物自由饮水,进食食料及动物垫料由南昌大学动物科技部提供,保持良好的通风,室温在23℃~25℃,相对湿度在45%~55%?

1.1.2药物:槲皮素?山奈酚?芦丁?β-雌二醇?羧甲基纤维素钠(CMC-Na)均由Sigma公司提供,产品批号SD?

1.1.3主要仪器设备1)MicroCT检测仪:由上海怀宇生物有限公司负责对股骨标本进行检测?(2)自动生化分析仪:由医院检验科负责对生化血?尿指标进行检测?(3)体重测量仪器:英恒精品分析天平?

1.2方法

1.2.1分组:SD大鼠51只,体重(.66±3.89)g,在标准动物饲养房内适应性饲养1w后,按体重随机分成6组,各组大鼠的初始平均体重差异无统计学意义(P0.05)?模型组(OVX组):对SD大鼠进行麻醉后,从大鼠背部正中做纵行皮肤切口,分别在两侧切开背部肌筋膜,找到双侧卵巢,对双侧输卵管进行结扎,切除双侧卵巢后进行肌筋膜及皮肤的缝合;假手术组(Sham组):在分别切开双侧肌筋膜找到双侧卵巢后,在卵巢附近切除与卵巢重量大致相等的脂肪组织,随后进行肌筋膜及皮肤的缝合;槲皮素组(Q+OVX组)?山奈酚组(K+OVX组)?芦丁组(R+OVX)及雌激素组(E2+OVX组)的造模过程与模型组相同?术后给予腹腔注射浓度为10mg/mL哌拉西林他唑巴坦钠注射液1mL,至术后第2天?术后第3天开始,Sham组?OVX组均每天给予3mLCMC-Na灌胃,Q+OVX组?K+OVX组?R+OVX组及E2+OVX组每天按照50mg/kg分别用槲皮素?山奈酚?芦丁?β-雌二醇给予灌胃,余量用CMC-Na溶剂补齐至3mL?每日观察SD大鼠的活动情况,定期更换垫料,保证饮水和食物充足,每周进行重新称重,对死亡大鼠进行解剖分析?总实验时间为12w?

1.2.2检测指标:体重:每周对大鼠进行称重1次,依据大鼠体重,调整给药剂量?实验结束时对大鼠子宫进行称重?生化指标:灌胃给药12w以后,用标准采血针从SD大鼠股动脉处进行采血,收集血样后立即送医院生化室进行离心,选取上层血清进行碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP),肌酐(S-Cr),钙离子(S-Ca)及磷离子(S-P)浓度测定?从大鼠膀胱抽取尿液,并检测尿液中钙离子(U-Ca)和磷离子(U-P)的浓度水平?Micro-CT骨量测定:分离SD大鼠左侧股骨,去除周围附着的软组织,置于Micro-CT线圈中,从大鼠股骨远端顶端开始进行CT螺旋扫描,每18μm作为一个断层,从生长板底端开始向上分析张,对松质骨进行三维重构,分别测定骨密度(bonemineraldensity,BMD)?骨小梁数量(structurelineardensity,Tb.N)?骨小梁厚度(structurethickness,Tb.Th)?相对骨体积(objectsurface/volumeratio,BV/TV)?结构模型指数(structuremodelindex,SMI)?

1.3统计学方法

各组大鼠的检测指标以均数±标准差

表示,用SPSS17.0统计软件做方差分析,进行组间比较?组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验,检验水准α=0.05?

2.1SD大鼠存活情况

整个实验期间,SD大鼠存活50只,OVX组死亡1只?死亡原因分析:死亡前1天,此大鼠灌胃时出现药物返呛,大鼠左侧胸前壁近腋前处可见包块,触之柔软?于次日死亡,解剖大鼠后可见左前胸部肌肉肿胀,有恶臭,可见少量黄色粉末,死亡原因考虑灌胃时用力过度灌胃针划破食管引起感染所致?

2.2各组大鼠平均体重以及子宫平均重量

与Sham组比较,OVX组及3种药物组大鼠的平均体重均明显升高(P0.01),E2+OVX组与Sham组平均体重差异无统计学意义(P0.05),并且小于3个药物组(P0.05);与OVX组比较,3个药物组平均体重差异无统计学意义(P0.05)?与Sham组比较,OVX组子宫平均重量低于Sham组(P0.01),加入雌激素后能够明显增加子宫重量(P0.01),3种药物组之间子宫平均重量无明显差异,但均能增加子宫体重(P0.05)?见表1?

2.3各组大鼠尿液中Ca?P的含量

与Sham组相比,OVX组及3个药物组U-Ca平均浓度明显升高(P0.01);与OVX组相比,3种药物组均能降低U-Ca的平均浓度(P0.05),但K+OVX组和R+OVX组作用更强(P0.01);与Sham组相比,OVX各组的U-P平均浓度明显升高(P0.01);与OVX组相比,3个药物组的U-P平均浓度减低(P0.05)?见表2?

2.4各组大鼠血清碱性磷酸酶的含量

与Sham组比较,OVX各组血液中ALP平均浓度增加(P0.05);与OVX组相比,山奈酚?芦丁均能不同程度增强OVX诱导的ALP活性的升高(P0.05)?槲皮素组的ALP与OVX组比较差异无统计学意义(P0.05)?见图1?

2.5各组大鼠Micro-CT股骨干骺端扫描结果和骨密度测定

从Micro-CT三维重构图可以看出,各组大鼠股骨之间的骨小梁存在不同程度的差别,且与BMD检测结果一致,即与Sham组比较,OVX组大鼠的BMD值均降低(P0.01),与OVX组比较,经过槲皮素?山奈酚以及芦丁药物治疗后,BMD增加(P0.05)?见图2?

2.6骨微结构检测结果

通过Micro-CT进行三维立体扫描,发现各组之间的骨性微结构存在一定程度的差异性?与Sham组相比,OVX各组骨样本中的BMD?Tb.N?Tb.Th?BV/TV均显著低于Sham组(P0.01),然而SMI含量相对增加(P0.01);与OVX组相比,槲皮素能一定程度上改善股骨微结构(P0.05),但效果不如山奈酚和芦丁作用明显(P0.01)?见表3?

大量研究证实杜仲能够对骨代谢发挥重要的作用,为了更充分地利用好其在骨代谢中的优点,对其复杂的化学成分进行逐一研究成为必然?杜仲中黄酮含量丰富,大量研究证实黄酮具有促成骨分化的作用,但其作用机制仍不十分明确?

黄酮亚类包括槲皮素?芦丁?金丝桃苷?山奈酚等,研究证明槲皮素对于脂肪来源的干细胞(adipose-derivedstemcell,ADSC)具有抑制增殖和促进成骨分化的作用,且对于促进成骨分化具有浓度依赖性?经槲皮素作用后的hADSC能够在颅骨缺损的小鼠中显示更好的骨再生能力,且研究证实槲皮素促进成骨分化是通过ERK通路进行的,也有一些研究认为槲皮素促进成骨是通过作用于细胞上雌激素受体而发挥作用的?Kim等通过研究山奈酚诱导的自噬对成骨细胞MC3T3-E1细胞分化和成矿的作用,证实山奈酚能够增加骨密度,改善骨微结构?另外,一项研究证明向去除卵巢的大鼠饮食中添加0.25%的芦丁能够减缓骨吸收,特别是能够抑制雌二醇缺失所致的骨量丢失?故而此次实验首先从黄酮类单体筛选出槲皮素?山奈酚以及芦丁3种药物进行对比分析,为后续关于杜仲的研究打下基础?

本研究选取了12周龄的SD大鼠,去势后造成绝经后骨质疏松大鼠模型(OP大鼠模型),结果显示空白组的雌激素水平,骨小梁厚度?骨表面积?骨密度测定值均显著高于OP模型组,表明造模成功?

骨是由骨矿物质与骨基质两大部分组成?由于骨细胞的活动,新骨不断形成,旧骨不断被沉积到骨上,同时又不断从骨中释放到血液循环中?通过测定血?尿中这些矿物质的含量也可以间接了解骨代谢情况?本实验的结果显示血清钙离子?磷离子以及肌酐浓度水平之间无明显差异性,而尿钙和尿磷的排泄,也就是钙磷吸收的降低,可能与骨密度的下降有一定相关性?这也与本实验结果一致,OVX组大鼠尿钙和磷的水平明显较Sham组高,而槲皮素?山奈酚?芦丁治疗能够显著降低尿钙和磷的水平,且山奈酚的作用效果优于槲皮素和芦丁?碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏?骨骼?肠?肾脏和胎盘等组织中的一种酶,是骨形成的标志?本实验发现OVX组大鼠的碱性磷酸酶活性明显升高,表明骨形成能力增强,但由于缺乏雌激素所导致骨吸收的增加大于骨形成,骨量减少,造成骨质疏松症的发生?在山奈酚和芦丁对OVX大鼠进行药物干预后,碱性磷酸酶水平显著升高,表明二者能够促进骨形成,增加骨转换?同时,实验也证实槲皮素对碱性磷酸酶活性无影响?

BMD被认为是目前唯一能够代表骨强度的测量标准?笔者通过测定大鼠股骨干骺端骨矿物含量?骨小梁厚度?骨小梁数量?相对骨体积等特定参数评估山奈酚?槲皮素?芦丁对成熟雌性大鼠体内成骨的影响?结果显示去卵巢大鼠在造模12w后,股骨BMD明显降低?另有研究表明粪便与尿液中钙的排泄减少和血液中钙的吸收增加可能有助于防止骨密度的降低,这与本研究结果中山奈酚?槲皮素?芦丁各组血清ALP活性水平增高?尿钙尿磷减低一致?以上各组通过抑制骨重塑来达到稳定骨量的结果与E2组的结果一致,且进一步表明山奈酚抗骨质疏松的作用强于芦丁和槲皮素?

植物性雌激素具有对骨的雌激素样作用,可增加BMD,抑制骨吸收?山奈酚?槲皮素?芦丁3者均具有类似植物雌激素抑制骨吸收的作用,并与雌激素竞争性参与雌激素受体(estrogenreceptor,ER)的结合?Dang等的研究表明,雌激素在刺激成骨细胞系的原始细胞向成骨细胞分化过程中起重要作用?鼠和人的ERs具有α和β两种亚型,ERβ亚型在骨组织的表达量高于ERα?ERα亚型主要分布于生殖细胞中,尤其是乳房和子宫?另一项研究表明,ERβ样免疫反应存在于小鼠和人类成骨细胞和骨细胞的细胞核中与破骨细胞和软骨细胞的细胞质中?ERβmRNA出现在小鼠成骨细胞中,其主要存在于干骺端骨小梁表面?OVX所导致的雌激素缺乏能显著增加大鼠体重,而E2能有效控制OVX大鼠体重的增加?本研究结果表明,山奈酚?槲皮素?芦丁均不能抑制OVX导致的大鼠体重增加,说明以上3种黄酮单体并不具有类似于E2调节OVX大鼠子宫生长的功能?研究还发现,山奈酚?槲皮素?芦丁均可增加BMD和改善骨小梁微结构,且子宫重量增加不如雌激素明显,表明这3种黄酮单体可能对ERβ比ERα有更高的亲和力?由此表明,杜仲黄酮对子宫低刺激性这一特点,使其比临床上其他预防骨质疏松症的药物具有更大优势?

另外,笔者采用Micro-CT对股骨的干骺端骨小梁微结构特性进行分析?结果提示OVX导致骨小梁结构不良,BV/TV?TB.N?Tb.Th均下降,骨小梁出现断裂甚至消失,而SMI指数显著升高?SMI是反映骨小梁板状和杆状程度的重要指标,0~3分别代表板状骨小梁和杆状骨小梁?本研究表明,药物治疗组骨小梁结构从杆状向杆状混合板状结构转变明显,尤其是山奈酚组?虽然槲皮素?芦丁?山奈酚组均能对骨小梁微结构改变有积极影响,但无论是雌激素治疗组还是药物治疗组均不能使骨小梁结构完全恢复?本研究结果与其他研究人员得出的结论一致,即骨小梁结构退化已经发生改变后,其结构完整性不能完全恢复?这一发现强调了预防骨小梁丢失的必要性?

综上所述,槲皮素?山奈酚和芦丁这3种药物均有抗绝经后骨质疏松的作用,且在相同的药物剂量下,山奈酚的作用效果最强,芦丁次之,槲皮素最弱?笔者通过分离大鼠右侧的股骨,已经提取并获得了以上各组大鼠的骨间充质干细胞,课题组将从蛋白以及基因层面对上述3种药物的抗绝经后骨质疏松的作用及其毒副作用进行更进一步的研究?

⊙本文来源于《中国骨质疏松杂志》,24(2)。全杜仲（quanduzhong)编校发布。编辑：款冬。内容仅供学习参考，如有侵犯版权请告知，我们将及时删除。